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常用的冷凍保存法包括：

①低溫冰箱保存法（－20℃、－50℃或－85℃）：低溫冷凍保存時(shí)使用螺旋口試管較為方便，也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜。保存時(shí)菌液加量不宜過多，有些可添加保護(hù)劑。此外，也可用φ5mm的玻璃珠來吸附菌液，然后把玻璃珠置于塑料容器內(nèi)，再放入低溫冰箱內(nèi)進(jìn)行保存的。

②干冰保存法（－70℃左右）：即將菌種管插入干冰內(nèi)，再置于冰箱內(nèi)進(jìn)行冷凍保存。

③液氮保存法（－196℃）：是適用范圍*的微生物保存法。其操作步驟如下，a、裝安瓶管：使用盡量濃厚的菌體懸浮于含有適當(dāng)防凍劑（保存霉菌不用防凍劑）的滅菌溶液中，將0.2～1ml的這種溶液分裝于安瓶中，或在裝有分散劑的安瓶中直接接種，或?qū)⒕z體瓊脂塊直接懸浮于分散劑中。

b、熔封安瓶管：若直接貯存于氣相液氮中（－150℃～－170℃）時(shí)，則不需熔封。

c、檢查安瓶管是否熔封良好：即在4℃下，將熔封安瓶管在適當(dāng)?shù)纳厝芤褐薪?～30分鐘后，觀察有無色素進(jìn)入安瓶。

d、緩慢冷卻：將熔封安瓶管置于小罐中，然后用液氮?dú)庖约s1℃/min的速度冷卻至－25℃左右，也可在－20℃～－25℃的冰箱內(nèi)緩慢冷卻30～60min。

e、速冷：最后浸入液氮中快速冷卻至－196℃。

7、冷凍干燥保存法：其原理是首先將微生物冷凍，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分。事實(shí)上，從菌體中除去大部分水分后，細(xì)胞的生理活動(dòng)就會(huì)停止，因此可以達(dá)到長(zhǎng)期維持生命狀態(tài)的目的。該方法適用于絕大多數(shù)微生物菌種（包括噬菌體和立克次氏體等）的保存。

在進(jìn)行冷凍干燥時(shí)，需注意以下幾個(gè)問題：

a、冷凍干燥前的培養(yǎng)條件：首先檢驗(yàn)菌種純度。一般地說，將待保存的微生物在營(yíng)養(yǎng)豐富且容易增菌的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)為宜；菌齡以達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為好；若為有芽孢或孢子的微生物，則以芽孢和孢子形成以后進(jìn)行保存為好；菌液濃度以高為好，如細(xì)菌應(yīng)達(dá)到109～1010/ml。

b、菌株號(hào)碼等的標(biāo)記：可在安瓶外側(cè)標(biāo)記或在安瓶?jī)?nèi)封入標(biāo)簽。

c、安瓶的準(zhǔn)備：將安瓶在2%HCl中浸泡過夜，自來水沖洗3次后，蒸餾水刷凈，干燥，塞棉塞，貼標(biāo)簽，干熱滅菌或溫?zé)釡缇螅?0℃恒溫干燥。

d、添加保護(hù)劑：常用的保護(hù)劑有脫脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉湯以及加7.5%葡萄糖的血清等等。

8、Bordelli氏法：取干凈的小試管（8×60mm）塞上棉塞，滅菌。用滅菌的脫脂牛乳洗脫試管斜面上的菌苔，制成濃厚菌懸液。然后用無菌吸管將菌懸液滴入小試管底部。每管一滴，然后轉(zhuǎn)動(dòng)小試管使菌液分散在試管底部的壁上。標(biāo)記菌名。將小試管裝在15×150mm的試管中，在大試管底部事先裝上1.5cm高的（P2O5或KOH），管口用帶玻璃管的橡皮塞塞緊，蠟封。將大試管與真空泵連通，抽真空至0.1～0.2mm汞柱時(shí)，將玻璃管熔封，置室溫暗處或冰箱保存。

儀器與材料1、斜面菌種：絲狀真菌、酵母菌、芽孢桿菌和無芽孢桿菌各一支。

2、接種用具一套。

3、滅菌物品：1ml、5ml吸管，長(zhǎng)滴管，安瓶管，9ml無菌水試管，砂土管，液體石蠟，脫脂牛乳。其中，液體石蠟的處理為1.5kg/cm2壓力滅菌1小時(shí)或1kg/cm2壓力滅菌3次，每次30分鐘。接著檢查是否*無菌，即接入肉湯中檢查有無雜菌生長(zhǎng)。最后放在60～80℃轟烤以去除水分。脫脂牛乳的處理為2000rpm離心10分鐘脫脂，然后0.5kg/cm2壓力滅菌20分鐘，或間歇滅菌3次，經(jīng)檢查無菌后備用。

4、P2O5，無水CaCl2各一瓶。

5、真空干燥器，真空泵。

方法1、液體石蠟覆蓋法：取待保存的菌種斜面，用5ml無菌吸管向內(nèi)加入滅菌石蠟，要求液體石蠟高出菌斜面1cm左右，若不夠此高度，則常會(huì)引起斜面抽干現(xiàn)象。

2、砂土管法：用1ml無菌吸管吸取0.2～0.5ml菌懸液，滴入砂土管中，充分混勻后，將砂土管放入真空干燥器內(nèi)，抽干，真空干燥器內(nèi)需放置無水CaCl2。最后，將干燥好的砂土管取出，迅速于火焰上蠟封管口，并在室溫下或冰箱中進(jìn)行保存。

3、冷凍干燥保藏法：

①用滅菌長(zhǎng)滴管取出2滴（約0.1ml）無菌脫脂牛乳，置于無菌安瓶管中，然后用另一支無菌滴管取出等體積的濃菌液，同樣置于此安瓶管中，充分混勻。

②集中安瓶管，置于100ml燒杯中，將燒杯裝進(jìn)真空冷凍干燥器的鐘罩內(nèi)，開機(jī)并開冷卻水后，使菌液在－20℃溫度下迅速凍結(jié)成固體，然后抽真空使水分升華，2小時(shí)后，可以停止冷凍并在稍高的溫度下進(jìn)行干燥，直至全干為止。

③最后取出安瓶管，并將其與真空泵連接，再抽真空后，迅速將安瓶管熔封，最后冰箱保存。

4、甘油管保藏法：在5ml菌種保藏管中，將等體積的菌懸液和40%的甘油充分混勻后，于－20℃冰箱中保存。